Реклама
Реклама
Реклама

ПАП-тест. Новые возможности

Как было показано в статье, опубликованной в журнале Science Translational Medicine, таргетированное секвенирование ДНК фетальных клеток, полученных с помощью мазка по Папаниколау (ПАП-мазка), может оказаться более совершенным вариантом пренатальной генетической диагностики, который, к тому же, будет возможен в более ранние сроки, чем это принято сейчас.  Инновационная стратегия основана на анализе ДНК трофобластов, которые могут проникать внутрь цервикального канала, и с ее помощью удалось распознать ДНК плода в 20 последовательных образцах. Это – начало пути к существенному улучшению пренатальной диагностики, которая теперь сможет начинаться уже в 5 недель гестации. Ожидается, что, если эффективность и безопасность этой технологии будет подтверждена в дальнейших исследованиях, и она будет одобрена профессиональными ассоциациями, эта методика будет очень охотно принята и врачами, и их пациентками.
Дело в том, что все три доступных в настоящее время варианта генетической диагностики плода имеют недостатки: амниоцентез и биопсия ворсин хориона представляют собой инвазивные исследования, которые, к тому же, проводятся на относительно поздних сроках (от 8 до 20 и более недель беременности), а исследование бесклеточной фетальной ДНК (неинвазивная пренатальная диагностика) затрудняется ее малым содержанием в крови матери.

В основе нового метода лежит тот факт, что трофобласты дают начало плаценте и несут такой же геном, как и у развивающегося эмбриона и, впоследствии, плода. Поэтому анализ ДНК из полученных с помощью ПАП-мазка трофобластов может дать ту же самую информацию, что и другие пренатальные тесты, но при этом менее инвазивен и может проводиться на более ранних сроках. Кроме того, новый анализ позволяет решить техническую проблему, связанную с выделением клеток плода среди существенно более распространенных материнских клеток и их ДНК.

Более ранние исследования показали принципиальную возможность генотипирования с использованием клеток из фрагментов ворсин хориона, которые проникают в цервикальный канал. В обсуждаемой работе группа исследователей из медицинской школы Университета Уэйна (государственный университет штата Мичиган, США) предложили «протокол изоляции ядер», который позволил отсеять из взятых из цервикального канала образцов большую часть материнской ДНК. Процедура начальной сепарации, названной TRIC («извлечение и изоляция трофобласта из шейки матки», trophoblast retrieval isolation from the cervix) проводится с помощью антител к антигену комплекса гистосовместимости HLA-G, которые нанесены на магнитные наночастицы. С их помощью удается собрать клетки, которые экспрессируют HLA-G. Этот человеческий лейкоцитарный антиген встречается только в трофобластах и клетках плаценты. Затем эти клетки наносятся на стекло, и производится изоляция их ядер, что позволяет элиминировать налипшие на них фрагменты материнской ДНК. Процедура завершается лизисом оголенных ядер трофобластов, в результате которого получается доступная для анализа фетальная ДНК.

Как пишут исследователи, использование этой новой методики для определения маркеров генетической патологии представляет собой простую альтернативу применяемым сейчас технологиям и позволяет с помощью ПАП-мазка получить интактные фетальные трофобластические клетки в достаточном количестве для применения новейших методов секвенирования уже в 5 недель беременности.

Исследователи обработали с помощью новой методики 20 последовательных образцов, взятых из цервикального канала и включавших фрагменты плаценты, которые были получены у беременных женщин на сроке от 5 до 19 недель. С помощью специального окрашивания, которое позволяло выявить бета-субъединицу хорионического гонадотропина человека, клетки были идентифицированы как фетальные, а с помощью флуоресцентной гибридизации in situ проводилась дифференциация между X и Y хромосомами.

С помощью таргетированного секвенирования было генотипировано 59 коротких тандемных повторов и 94 однонуклеотидных варианта, которые охватывали 24 человеческих хромосомы. Плацентарная ДНК служила контролем, поскольку, по понятным причинам, она должна была совпадать с ДНК плода. Следует отметить, что в данной публикации термин «фетальный/плодный» употребляется также применительно к образцам, полученным в эмбриональном периоде, поскольку он традиционно используется таким образом и в контексте амниоцентеза или биопсии ворсин хориона.

Все 20 фетальных образцов совпали с плацентарными, что указывает на высокую степень распознавания фетальных генетических маркеров на фоне генома матери. Средняя доля плодной ДНК оставила 92,2% ± 6,5%, что означает минимальную степень контаминации материнской ДНК. Для сравнения: фетальная фракция бесклеточной ДНК плода в материнском кровотоке в 10 недель беременности составляет всего лишь 4-10%.

Новая технология обладает целым рядом потенциальных преимуществ. Во-первых, в отличие от других методик, на ее возможности не будет влиять значение индекса массы тела женщины. Во-вторых, это неинвазивный тест, на который очень многим пациентам, видимо, будет легче решиться. В-третьих, новый анализ может проводиться на более ранних сроках беременности. Наконец, он технически проще, чем проводящаяся сейчас неинвазивная пренатальная диагностика. По мнению экспертов, новый способ получения генетического материала плода обладает огромным коммерческим потенциалом, поскольку его целевой аудиторией будут являться выделяемые уже сейчас группы пациентов.
Тем не менее, опубликованная работа имеет свои ограничения. Первое из них – малый размер выборки. Второй феномен, который потенциально может огранивать применимость новой методики не связан с технологией как таковой. Это совершенно естественное явление – плацентарный мозаицизм. Дело в том, что возникновение соматической мутации в одной из клеток плаценты или, наоборот, эмбриона/плода может приводить к генетическим различиями между будущим ребенком и трофобластом, результатом чего могут быть как ложно-положительные, так и ложно-отрицательные результаты анализа. Значимость такого мозаицизма пока не до конца изучена, и он представляет собой потенциальную проблему для всех подходов к пренатальной диагностике.

В настоящее время необходима валидизация новой методики на более крупных выборках. Если при этом удастся воспроизвести результаты этой первой работы, и новый подход получит поддержку профессиональных ассоциаций, у него есть все шансы быстро занять доминирующее место на рынке.

ВЕРНУТЬСЯ К СПИСКУ СТАТЕЙ
ИЗМЕНЕНО: 06.09.2018 ПРОСМОТРЕЛИ: 5908
Реклама
Реклама
Реклама